聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点)
来源：峰值财经 发布时间：2023-06-07 浏览量：次
简介——什么是电泳？
电泳是根据基质上的净电荷、大小和构象对核酸（DNA 和 RNA）和蛋白质等大分子进行分离纯化的方法。由于磷酸基团的存在，核酸具有整体负电荷。因此，它们向阳极移动的速度完全取决于它们的大小。蛋白质含有整体的正电荷或负电荷；这使得蛋白质分子能够向一个称为等电点的 pH 移动，在该等电点分子没有净电荷。通过对蛋白质进行变性，并给予它们均匀的电荷，就可以根据大小将它们分开。大分子在由琼脂糖或聚丙烯酰胺组成的基质或凝胶内电泳。由这些聚合物制成的凝胶含有孔隙，当施加电压时，蛋白质和核酸可以通过这些孔隙。更多内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn
DNA 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从海藻中提取的多糖，通常以0.5-2％的浓度用于DNA和RNA电泳。它可形成具有合适孔径的晶格，以便核酸能够移动到正极。
实验方案：DNA 琼脂糖凝胶电泳
所需材料和试剂
电泳室，包含电源、灌胶板和点样梳
Bionic™ 缓冲液 (B6185) 或下列其中一种电泳缓冲液:
1X TAE (65497) ，包含：
0.04 M Tris-醋酸盐 (pH 7.6)
0.001 M EDTA
或
1X TBE (93290)，包含：
0.13 M Tris (pH 7.6)
45 mM硼酸
2.5 mM EDTA
上样缓冲液 (G7654, G2526) 或在 1X TAE 或 1X TBE 中使用以下材料制备：
50% 甘油
0.25% 溴酚蓝 (B5525)
0.25% 二甲苯腈蓝 FF (X4126)
BlueView™ 核酸染色剂（T9060和T8935 ）、SYBR® Green核酸染色剂 (S9430) 或溴化乙锭：在蒸馏水中制备0.5μg/ mL。
透射仪
也可通过以下步骤自行灌制琼脂糖凝胶。
琼脂糖溶液制备
量取适量琼脂糖粉，加到烧杯或烧瓶中的 1X TAE 缓冲液中。
说明：琼脂糖量取决于所需凝胶的百分比。琼脂糖溶液的体积必须根据所用凝胶拖盘的大小来制备在磁性加热板上加热溶解琼脂糖。也可在微波炉中加热，每分钟旋转一次，直到琼脂糖完全溶解。
当琼脂糖冷却至 50-60°C 时，向溶液中加入溴化乙锭（0.5µg/mL 最终浓度）。另一种方法是电泳后将凝胶浸入溴化乙锭溶液中。
重要提示： 溴化乙锭是一种致癌剂。处理溴化乙锭时务必佩戴手套和口罩。琼脂糖冷却时，准备好凝胶托盘以进行灌胶，使琼脂糖溶液在凝固前不会流出。这可以通过使用托盘隔障、Flexicaster或用传统的实验室胶带密封来实现。将梳子置于凹槽中，并将托盘置于平坦的水平位置。
慢慢倒入琼脂糖溶液，使其均匀地分布在托盘上，确保没有气泡滞留在凝胶中。使凝胶在室温下固化。
取出梳子，用托盘将凝胶转移到电泳槽，加入1X电泳缓冲液，直到凝胶刚好被缓冲液覆盖。
DNA 样品制备
Sigma-Aldrich 提供 GenElute™ 试剂盒，用于从植物和真菌 ( E5038 )、哺乳动物细胞或组织 (G1N70, G1N10 and G1N35) 、以及血液(NA2010 和 NA2020)中分离 DNA。
为保护分离的 DNA 不被降解，建议将 DNA 溶解在 TE 缓冲液中 ( T9285 )。
此外，DNAstable® 试剂盒 (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML 和 93121-017-1EA)可用于DNA运输或确保DNA在室温下的储存和稳定。
按标准方法从细胞或组织中分离 DNA。
用溴化乙锭染色时，在琼脂糖凝胶上检出所需的最低 DNA 浓度为 2 ng。
将核酸样品与 10X 上样缓冲液混合。一般情况下，3 μL 上样缓冲液就足够了，但少于 10 μL 的样品可使用更少的量。
凝胶电泳
使用移液器将样品小心地加入孔中。也可加入含有各种大小核酸片段的适当标记物(D7058, D3937, D3812)。
盖上电泳槽盖子并连接电源。样品在琼脂糖凝胶中电泳的常用电压为 90-150v。
应使用橙色 G ( O3756 )、溴酚蓝 ( B8026 ) 或二甲苯靛蓝 ( x4126 ) 追踪染料前沿。
凝胶染色和观察
掺入溴化乙锭的凝胶：
电泳后，将凝胶转移至紫外透射仪，并获取凝胶图像。
样品将显示为亮带。
未掺入溴化乙锭的凝胶：
将电泳后的凝胶转移至SYBR® Green核酸染色剂（1:10,000 稀释，避光染色）或 0.5µg/ml 溴化乙锭染色溶液中 15-30 分钟。
如果使用 SYBR® Green 核酸染色剂，则可在染色后立即获取凝胶图像。
如果使用溴化乙锭，将凝胶置于蒸馏水中 10-30 分钟，确保凝胶完全浸入水中。
将凝胶转移至紫外透射仪并获取凝胶图像。
样品将显示为亮带。
琼脂糖凝胶荧光染色
Sigma-Aldrich可提供 Nancy-520 (01494)，这是一种可用于替代溴化乙锭的荧光染色剂。它是一种更安全、更稳定、更环保的溴化乙锭替代品。Nancy-520 的激发波长为 520 nm，发射波长为 560 nm。
掺入Nancy-520 的凝胶：
灌胶时可将 Nancy-520 掺入琼脂糖中（10 μL 至 50 mL 琼脂糖）。
电泳后，获取凝胶的荧光图像。
未掺入 Nancy-520 的凝胶：
加入 10 μL Nancy-520 至 50 mL 1X TBE 缓冲液制备染色液。
电泳结束后，将凝胶浸入染色液中，并在摇床上避光保存 1小时。
用 1X TBE 缓冲液冲洗凝胶 10-30 秒。
拍摄凝胶的荧光图像。
图 2.水平电泳系统
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